Replikasi DNA
Replikasi DNA yang terjadi, disebut replikasi semikonservatif, karena
masing-masing dari kedua rantai DNA induk bertindak sebagai
cetakan/templat untuk pembuatan dua rantai DNA dengan untai ganda yang
baru.
[1][2]
Replikasi DNA adalah proses penggandaan rantai ganda
DNA. Pada
sel, replikasi DNA terjadi sebelum
pembelahan sel.
Prokariota terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada
eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S
siklus sel, sebelum
mitosis atau
meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan
enzim DNA polimerase yang membantu pembentukan ikatan antara
nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA. Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan
in vitro dalam proses yang disebut
reaksi berantai polimerase (PCR).
=Garpu replikasi
Garpu replikasi atau cabang replikasi (
replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim
helikase yang memutus
ikatan-ikatan hidrogen
yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda
tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah
untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan"
untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida
komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan
memperpanjang oligonukleotida yang dibentuk oleh enzim
primase dan disebut
primer.
DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan
nukleotida—dalam hal ini, deoksiribonukleotida—ke ujung 3'-hidroksil
bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai
DNA baru disintesis dari arah 5'→3', sedangkan DNA polimerase bergerak
pada DNA "induk" dengan arah 3'→5'. Namun demikian, salah satu untaian
DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3'→5', sementara untaian
lainnya berorientasi 5'→3', dan helikase bergerak membuka untaian
rangkap DNA dengan arah 5'→3'. Oleh karena itu, replikasi harus
berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.
Replikasi DNA. Mula-mula, heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua
untai tunggal oleh enzim helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11)
yang mengurangi tegangan untai DNA. Untaian DNA tunggal dilekati oleh
protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya
membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk oligonukleotida
RNA yang disebut
primer (5) dan molekul DNA polimerase (3 &
8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untai
tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang
disebut
leading strand (2) dan
lagging strand (1). DNA polimerase yang membentuk
lagging strand
harus mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut
fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan
potongan-potongan
lagging strand tersebut.
Pembentukan leading strand
Pada replikasi DNA, untaian pengawal (
leading strand) ialah
untaian DNA yang disintesis dengan arah 5'→3' secara berkesinambungan.
Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung
3'-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara
berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan garpu replikasi.
Pembentukan lagging strand
Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan
leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut
fragmen Okazaki.
Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan
demikian dapat menggunakan gugus OH 3' bebas pada primer RNA tersebut
untuk mensintesis DNA dengan arah 5'→3'. Fragmen primer RNA tersebut
lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan
deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya
ditempati oleh RNA.
DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis
lagging strand menjadi lengkap.
Dinamika pada garpu replikasi
Bukti-bukti yang ditemukan belakangan ini menunjukkan bahwa enzim dan
protein yang terlibat dalam replikasi DNA tetap berada pada garpu
replikasi sementara DNA membentuk gelung untuk mempertahankan
pembentukan DNA ke dua arah. Hal ini merupakan akibat dari interaksi
antara DNA polimerase,
sliding clamp, dan
clamp loader.
Sliding clamp pada semua jenis makhluk hidup memiliki struktur
serupa dan mampu berinteraksi dengan berbagai DNA polimerase prosesif
maupun non-prosesif yang ditemukan di sel. Selain itu,
sliding clamp berfungsi sebagai suatu faktor prosesivitas. Ujung-C
sliding clamp
membentuk gelungan yang mampu berinteraksi dengan protein-protein lain
yang terlibat dalam replikasi DNA (seperti DNA polimerase dan
clamp loader). Bagian dalam
sliding clamp memungkinkan DNA bergerak melaluinya.
Sliding clamp tidak membentuk interaksi spesifik dengan DNA. Terdapat lubang 35A besar di tengah
clamp ini. Lubang tersebut berukuran sesuai untuk dilalui DNA dan air menempati tempat sisanya sehingga
clamp
dapat bergeser pada sepanjang DNA. Begitu polimerase mencapai ujung
templat atau mendeteksi DNA berutas ganda (lihat di bawah),
sliding clamp mengalami perubahan konformasi yang melepaskan DNA polimerase.
Clamp loader merupakan protein bersubunit banyak yang mampu menempel pada
sliding clamp dan DNA polimerase. Dengan
hidrolisis ATP,
clamp loader terlepas dari
sliding clamp sehingga DNA polimerase menempel pada
sliding clamp.
Sliding clamp
hanya dapat berikatan pada polimerase selama terjadinya sintesis utas
tunggal DNA. Jika DNA rantai tunggal sudah habis, polimerase mampu
berikatan dengan subunit pada
clamp loader dan bergerak ke posisi baru pada
lagging strand. Pada
leading strand,
DNA polimerase III bergabung dengan
clamp loader dan berikatan dengan
sliding clamp.
Replikasi di prokariota dan eukariota
Replikasi DNA prokariota
Replikasi DNA
kromosom prokariota, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada
E. coli,
misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA,
yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan
dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan
dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat
tinggi; DNA kromosom prokariota dapat mengalami reinisiasi replikasi
pada dua ori yang baru terbentuk sebelum putaran replikasi yang pertama
berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom
yang sebagian telah bereplikasi.
Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga
40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP.
Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini
memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA
berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan
pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT
sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan
enzim
helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.
Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh
protein
pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk
melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah
renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan
menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi
sintesis pada untai pengarah. Agar replikasi dapat terus berjalan
menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena
pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa
superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami
ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim
lain, yaitu
topoisomerase tipe II yang disebut dengan
DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan
antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA
bakteri.
Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada
untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu
kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer
dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase
DnaB dan DNA primase.
Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami
elongasi
dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini
merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh
lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada
kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.
Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas
subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e,
yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa
eksonuklease 3’– 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.
Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase
III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh
hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai
aktivitas polimerase 5’ – 3’, eksonuklease 5’ – 3’, dan eksonuklease
penyuntingan 3’ – 5’. Eksonuklease 5’ - 3’ membuang primer, sedangkan
polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya,
fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim
DNA ligase. Secara
in vivo,
dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk
kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya
replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap
detik.
Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180 °C dari
ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan
menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain
berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika
replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu.
Pemisahan dilakukan oleh enzim
topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.
Replikasi DNA eukariota
Pada
eukariota, replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam
interfase.
Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks
yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent
protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal
pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan
fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk
inisiasi pada masing-masing ori.
Berhubung dengan kompleksitas struktur
kromatin,
garpu replikasi pada eukariota bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb
tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari
nukleosom
pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat
menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini
diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom
pada kebanyakan
mamalia.
Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon
mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S.
Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah
eukromatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah
heterokromatin. Daerah
sentromer dan
telomer
dari DNA bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan
aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor
inisiasi.
Seperti halnya pada prokariota, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau
replication protein
A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga
DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan
masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer
dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim
DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan
elongasi
replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada
untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA
polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA
polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya
antigen
perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA),
yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III
pada
E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan
histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.
Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan
dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear.
Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan
melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan
analog
timidin,
yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli
tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang
mengenali BUdR.
Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak
ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’
untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari
DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariota (telomer)
mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi
informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase
mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer
dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai
cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.
Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas
telomerase
mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme
multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada
tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa
informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini
diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan
penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel
kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.
Pengaturan replikasi
Rujukan
- ^ (Inggris)Geoffrey M. Cooper (2000). The Cell - A Molecular Approach (edisi ke-2). Sunderland (MA): Sinauer Associates. hlm. Heredity, Genes, and DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses pada 13 Agustus 2010.
- ^ (Inggris)Geoffrey M. Cooper (2000). The Cell - A Molecular Approach (edisi ke-2). Sunderland (MA): Sinauer Associates. hlm. Figure 3.8. Semiconservative replication of DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses pada 13 Agustus 2010.